A jelen szabadalom eljárást ír le

- egyrészt egy szuperoxid diszmutáz enzim növényi csírákból való kivonására és tisztítására,

- másrészt a fenti enzim kombinálására peroxidáz enzimmel és annak kofaktorával. Ez az enzimkomplex stabil formában kozmetikai, gyógyszerészeti és élelmiszeripari célokra használható.

Bevezetés

Pontosabban az eljárás célja, hogy szuperoxid diszmutázt (a továbbiakban rövidítve: SOD) nyerjünk ki csíráztatott növényi magvakból. A magvakat a csírázás olyan állapotában használjuk, amelyben az enzim-aktivitás erőteljes, és az enzimek stabilitása is magas, mikor a kivont SOD-t szabad gyökök elleni készítményekben használjuk olyan más enzimmel kombinálva, amelyképes a szuperoxidok lebontásakor keletkező melléktermékek (l hidrogén-peroxid) eltávolítására. Ilyen enzimek a katalázok és a peroxidázok. A találmány így előnyösen alkalmazható kozmetikai, gyógyszerészeti, bőrgyógyászati és élelmiszeripari vegyületekben.

A szabad gyökök olyan atomok, vagy molekulák, melyek külső pályáján az elektron pár egyik tagja hiányzik. Ezek a részecskék rendkívül instabilak, és a legstabilabb molekulákkal is képesek reakcióba lépni, hogy szabad elektronjukat lekössék.

Oxigén-tartalmú szabad gyökök a szervezetben folyamatosan képződnek úgy a mitokondriumokban, mint a fagocitózis során. Fizikai hatások, mint az ultraibolya sugárzás, vagy környezeti tényezők is okozhatnak szabad gyök-képződést a szervezetben. Ilyen környezeti tényezők pl. a gépjárművek szennyező gázkibocsátása, a dohányzás, az ionizáló sugárzás stb.

Az oxigén szabad gyökként a molekuláris oxigén részleges redukciójával keletkezik. Ha az oxigén-molekula egy többlet-elektront vesz fel, kialakul az 02- szuperoxid gyök. Ez az anion csak kevéssé reaktív, de egyéb, nagyon is reaktív gyökök képződhetnek belőle. A szuperoxid gyök enzimes átalakítását az SOD végzi, melynek hatására hidrogén peroxid képződik. Ez vas jelenlétében rendkívül reaktív hidroxil-gyököt képez.

Nagy reakciókészségük miatt a szabad gyökök a sejt bármely vegyületét megtámadhatják, súlyos elváltozásokat okozva. A bőrben a gyökök, különösen a szuperoxid gyök fő célpontja a kollagén, de az elasztin rostokat, a glükóz-aminoglikánt, a proteoglikánt, a DNS -t, valamint a sejtmembrán foszfolipidjeit is támadja.

A kollagén és az elasztin rost a szabad gyököket közvetlenül felveszi, különböző káros elváltozásokat szenvedve: a polimer láncok felszakadnak, kisméretű peptidek szakadnak le, melyeket a proteáz enzimek lebontanak, a polimer láncok közt új kötések keletkeznek, melyek a rugalmasságot rontják.

Hogy az oxigén aktivált formájának romboló hatásával szembeszálljunk, egyre fontosabb, hogy minden lehetséges területen, de főleg a kozmetika, a gyógyszerészet és az élelmiszeripar területén antíoxidáns-alapú készítményeket alkalmazzunk. A kozmetikumok között már vannak ilyenek, melyeket "öregedés elleni" szereknek neveznek.

A szakterület jelenlegi állása

A jelenleg a kozmetikai és gyógyszeripar által használt antioxidánsok vagy a szabad gyököket befogó vegyi anyagok, vagy enzimrendszerek. Ez utóbbiak nagy hátránya, hogy még szobahőmérsékleten is nagyon gyenge a stabilitásuk.

Lipofil csapdaként az E-vitamin és a karotin használatos. Ezek a sejtmembrán részei, a lipidek peroxidációja ellen védenek azáltal, hogy a kialakult peroxid gyököket redukálják. Hidrofil antioxidánsként általában a C-vitamin használatos. Ez vizes közegben véd a peroxi- és a hidroxil gyökök ellen. Használnak még enzim-kofaktorokat is, így a glutationt és a cinket. Az előbbi számos gyökök ellen védő enzim alkotója, míg az utóbbi a réz-cink alapú SOD része.

A kozmetikai-és gyógyszeriparban SOD-t használnak. Ennek szerepe a szervezetre, különösen a bőr szöveteire vélhetőleg ártalmas szuperoxid gyökök azonnali semlegesítése. A katalizált reakció az anion átalakítása hidroén-peroxiddá.

Búzacsírából több SOD izo-enzimet is kivontak már pld. Beauchamp (Biochimica et Biophysica Acta, 317 (1973) 50-64) három enzimet izolált, melyből kettő Cu/Zn-alapú SOD volt. A Cu/Zn SOD a hámszövetek első enzimes védővonalát alkotják, azok ellen a szabad gyökök ellen, melyek az ultraibolya sugárzás hatására keletkeznek. Érdekes megjegyezni, hogy melyek az ultraibolya sugárzás hatására magának az enzimnek is csökken a hatása.

A L'Oreal z US-A-4, 129,644 sz. irat szerint SOD-t javasolt használni olyan készítményekben, melyek célja a haj keratin-szerkezetének megőrzése, illetve a bőr és a haj védelme. Ezt az enzimet főleg szarvasmarha-vérből, illetve egyes mikroba-törzsekből vonták ki.

Szintén a L'Oreal ajánlotta különböző: (emberi, állati, bakteriális, élesztő, biotechnológiai) eredetű SOD-k, valamint egy foszforsav-származék együttes használatát. Ez utóbbi fémes komplexeket képez, szerepe a hámszövet védelme elöregedés és sugárzás ellen, azon az alapon, hogy egyes fém-komplexek képesek a mérgező hidroxil-gyökök megkötésére.

A Nippon olyan terméket szabadalmaztatott, amely stabilizált SOD-t, foszfátot, alkálifémkloridot és szőlőcukrot tartalmaz. Ók az SOD-t emberi vérből vonták ki.

Az Inocosm olyan eljárást szabadalmaztatott, mely többféle SOD keverékét nyeri ki gabonacsírából, bonyolult alkoholos kivonással. Az így nyert SOD aktivitása igen gyenge, és a felhasznált oldószerek nehézkessé teszik az alkalmazását is. Jelenleg az ipari SOD-t a vágóhidakon nagy mennyiségben rendelkezésre álló szarvasmarha-vér vörös vértestjeiből vonják ki.

Másrészt, Beauchamp et a1. Biochimica et Biophysica Acta, 317 (1973) 50-64 oldalán megjelent cikke óta ismert, hogy az SOD búzacsírából is kivonható. Valamint az is, hogy az Inocosm által növényi SOD kivonására bejelentett legalább egy eljárás hozama igen alacsony, részben a csíra alacsony SOD-tartalma, részben a kivonásra használt oldószeres eljárás alacsony hatékonysága miatt.

Így a jelen eljárás fő célja, hogy megoldást hozzon nagymennyiségű növényi SOD ipari léptékű kivonására magas hozammal, különös tekintettel a kozmetikai, gyógyszer-és élelmiszeripari alkalmazásra.

Másik célunk olyan új eljárás kidolgozása, mely a növényi SOD-t különösen aktív, ugyanakkor különösen stabil formában vonja ki. Lehetőleg az aktivitás 80 %-ának megőrzése 35 napig szobahőmérsékleten, valamint 50 %-nak megőrzése 45,oC-on. Ez utóbbi lehetővé tenné, hogy a szabad gyökök ellen védő kozmetikai, gyógyszer- és élelmiszeripari termékekbe hatékonyan bedolgozható legyen.

Ez a két műszaki probléma először nyert egyidejűleg egyszerű biztonságos megoldást, mely váratlan eredmény, és a szakember számára nem magától értetődő.

Egyik megoldás szerint a növényi magvak lehetnek gabona, pillangós növények magvai vagy olajosmagvak..Bármelyik gabonafaj használható, leginkább az árpa, mely lehet akár tavaszi, akár őszi fajta. Pillangós növények közül a lencse és a borsó a legalkalmasabb, míg az olajosmagvak közül a szója.

Másik megoldás szerint a magvakat előcsíráztatjuk, amíg az SOD aktivitása megnő. Az Előcsíráztatás ideje az adott növényfajtól függ. Inkább javasolt a magvak előcsíráztatása néhány napig, csírázás-serkentő anyag  pl. gibberellin tartalmú vizes oldatban. Az előcsíráztatás történhet hideg vizes áztatással is, mintegy 2  napig,. majd az enzimaktivitás növekedését csírázásserkentő, pl. gibberellin hozzáadásával indítjuk be. 

Az SOD kivonása vizes oldatba történik. A megőrölt csírát 8 körüli pH kémhatású, szobahőmérsékletű vízben áztatjuk, néhányszor 10 perctől néhány óra közt változó ideig, mely alatt az SOD kioldódik. Ezután az oldatot szűrjük, a szűrlet tartalmazza az SOD-t. Előnyös, ha a szűrletet üledékképző ágenssel tovább tisztítjuk, így ugyanis a nemkívánatos oldott proteinek kicsapódnak. Ilyenkor a felülúszó tartalmazza az SOD-t.

A kivonat H202-csapda (pld. Peroxidáz, vagy peroxidáz kofaktor) hozzáadásával stabilizálható. A stabilitás még fokozható legalább egyféle cukor (akár mono-, a kár poliszaccharid) hozzáadásával. Sokféle peroxidáz ismert, pl. a gerincvelöböl kivont mielo-peroxidáz, a tejből kivont lakto peroxidáz, a szarvasmarha-, illetve embervérből kivont glutathion-peroxidáz, illetve leginkább a feketeretekből kivont "raifort"-peroxidáz.

Jelen eljárásban a SOD-peroxidáz komplex kialakításához leginkább a növényi eredetű különösen a feketeretekből kivont - peroxidáz használatát helyeseljük. Ez elönyösen kiegészíthető a hozzátartozó kofaktorral, ami húgysav, illetve aszkorbinsav lehet.

Az eljárás egy további változata szerint a SOD-peroxidáz-kofaktor komplex tovább stabilizálható a komplex 10-50 %-át kitevő mennyiségű, legalább egyféle cukor hozzáadásával. Más változatban lipofil antioxidánst adunk a komplexhez, például valamely tokoferol  származékot, alkalmasint foszfátot, mivel a tokoferol-foszfát váratlan mértékben megnöveli a S0D stabilitását.